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鸡树条荚蒾组培再生体系的建立

?作者: 组培设备 发布时间:2019-12-14 09:42?? 浏览次数:

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  鸡树条荚蒾(Viburnum sargenti Koehne)为忍冬科(Caprifoliaceae)荚蒾属(Viburnum Linn.)植物,广布于黑龙江省小兴安岭、张广才岭及老爷岭等地区。鸡树条荚蒾为落叶灌木,聚伞形花序生于枝梢顶端,球果核形,耐寒、喜湿润,在微酸、微碱性土壤中均可正常生长。鸡树条荚蒾不仅具有较高的观赏价值,还具有很高的药用价值,其茎中含有人体必需的脂肪酸,可用于治疗类风湿性关节炎,该树种在园艺观赏及药用等方面都具有很高的开发利用价值。

  目前鸡树条荚蒾的繁育较困难,主要以种子繁殖为主,但其种子具有深休眠特性,而扦插繁殖又存在生根率较低等问题。组织培养技术因具有繁殖系数高、不受季节限制、保持无性系优良特性等优点,被认为是一种可在短期内实现荚蒾规模化繁育的手段。近年来,荚蒾属植物的组培研究倍受关注,其中,香荚蒾(Viburnum farreri)、地中海荚蒾(Viburnum tinus)及欧洲荚蒾(Viburnum opubus L.)等均已建立相应的茎段再生体系,并获得再生植株。但有关鸡树条荚蒾的组培再生研究相对较少。为此,试验采用正交设计,研究不同激素配比对鸡树条荚蒾茎段和叶片分化及再生的影响,建立其组培再生体系,旨在为鸡树条荚蒾的组培快繁及基因工程育种奠定基础。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  以黑龙江省哈尔滨市建设银行培训学校校园内成年已开花且无病虫害的鸡树条荚蒾为试验材料,选择来源于同一健壮植株基部萌生的嫩枝,经过消毒处理后进行离体快繁并获得大量组培苗。

  WPM 培养基:400 mg/L NH4NO3、370 mg/L MgSO4·7H2O、96 mg/L CaCl2·2H2O、8.6 mg/L ZnSO4、0.25 mg/L CuSO4、27.8 mg/L FeSO4、990 mg/L K2SO4、170 mg/L KH2PO4、22.4 mg/L MnSO4、6.2 mg/L H3BO3、0.25 mg/L NaMoO2·2H2O、37.3 mg/L Na2EDTA、0.1mg/L 盐酸硫胺素、0.5 mg/L盐酸吡哆辛、0.5 mg/L烟酸、2.0 mg/L甘氨酸、100 mg/L肌醇、25 mg/L蔗糖、5.8 mg/L琼脂、0.01~1.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.01~1.0 mg/L吲哚丁酸、0.000 1~0.01 mg/L噻苯。诱袅笏瞥,pH值为5.8。

  1.2 试验方法

  1.2.1 外植体的预处理和消毒 将流水冲洗过的茎段用70%酒精消毒20 s,其间充分震荡,使酒精与茎段表面充分接触,取出茎段用无菌水清洗3遍;然后用3%的次氯酸钠消毒10 min,充分震荡使次氯酸钠与茎段表面充分接触,再依次用无菌水清洗3遍,最后用无菌滤纸吸干茎段表面的水分;用无菌剪刀将茎段两端已被消毒液氧化的部分剪掉,再将剩余茎段剪成仅包含一个腋芽的小段,接种到生根培养基上。

  1.2.2 激素种类与浓度对茎段不定芽、叶片愈伤组织诱导的影响 将带有芽点的茎段(约2~3 cm)按1.2.1的方法消毒后垂直接种到WPM培养基上进行分化培养,其激素采用L9(34)正交试验设计(表1),设置6-BA、IBA、蔗糖3个因素,每个因素设置3个水平,6-BA为1、2、3 mg/L,IBA为0.1、0.2、0.3 mg/L,蔗糖为10、20、30 g/L。

  表1 不同激素浓度对茎段分化的影响L9(34)正交设计

  

 

  选取生长旺盛的叶片按1.2.1的方法消毒后剪成1 cm×1 cm大。又钟谔砑50 mg/L 维生素C(VC)及50 mg/L活性炭(AC)的WPM培养基进行愈伤组织的诱导,其激素种类与浓度采用L9(34)正交试验设计(表2),设置6-BA、IBA、2,4-D 3个因素,每个因素设置3个水平,6-BA为1、2、3 mg/L,IBA为0.1、0.2、0.3 mg/L,2,4-D为1、2、3 mg/L。

  表2 不同激素浓度对叶片愈伤组织诱导的影响L9(34)正交设计 (mg/L)

  

 

  培养温度为(25±2)℃,光照16 h/d,光照强度2 000 Lx。每个处理接种30个外植体,重复3次,接种60 d后,统计茎段分化率及叶片愈伤组织的诱导率。

  1.3 继代周期对不定芽诱导的影响

  将茎段垂直接种到含有2 mg/L 6-BA及0.2 mg/L IBA的WPM培养基上进行茎段分化培养,分别以20、25、30、35、40 d为继代周期,每个处理接种30个外植体,重复3次,观察植株长势,培养60 d时,统计增值倍数、株高。

  1.4 不同激素浓度对不定芽生根的影响

  待诱导分化形成的不定芽伸长至2~3 cm时,接种于含有 0、0.5、1、2、3 g/L AC,1、1.5、2 mg/L IBA或1、1.5、2 mg/L NAA的WPM培养基中诱导生根,培养温度为(25±2)℃,光照16 h/d,光照强度2 000 Lx。每个处理接种30个外植体,设置3次重复,接种40 d后,统计不定芽的生根数量和株高,计算生根率。对生根组培苗进行炼苗和移栽,30 d后统计苗木移栽成活率。

  1.5 数据统计及分析

  试验数据采用SPSS18.0软件进行方差分析,用Duncan检测方法进行多重比较。

  茎段不定芽分化诱导率=(分化外植体数/接种外植体总数)×100%

  叶片愈伤组织诱导率=(获得愈伤组织外植体数/接种外植体总数)×100%

  不定芽生根率=(生根外植体数/接种外植体总数)×100%

  增值倍数=增殖芽数/接种外植体总数

  2 结果与分析

  2.1 不同激素浓度对茎段不定芽诱导的影响

  

 

  图1 鸡树条荚蒾茎段不定芽诱导

  (A:接种10 d时茎段长势;B:接种30 d时不定芽的分化;C:接种45 d时不定芽的长势。)

  茎段垂直接入分化培养基培养15~20 d后,基部有愈伤组织形成,培养30 d后,出现不定芽,45 d左右不定芽伸长至3~4 cm(图1)。通过比较K值(表3)可知,当6-BA浓度为2 mg/L、IBA浓度为0.2 mg/L、蔗糖浓度为20 g/L时,分化率最高,为93.66%。由极差分析(表3)可知,6-BA、IBA、蔗糖的极差分别为28.63、13.06、1.11,即:影响分化的主要因素为6-BA,其次是IBA,最后是蔗糖。在一定范围内,随着6-BA浓度的增加,茎段分化率呈现先升高后降低的变化趋势。当6-BA浓度超过2 mg/L、IBA浓度超过0.2 mg/L时,不定芽伴有一定的玻璃化现象,说明高浓度的6-BA和IBA对不定芽的分化及生长有一定的抑制作用。由此确定鸡树条荚蒾茎段分化的培养基为:WPM+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖。

  表3 不同激素浓度对茎段不定芽诱导的影响

  

 

  注:k1、k2、k3分别代表水平1、水平2、水平3的平均指标,R表示诱导率的极差。下同。

  2.2 激素种类与浓度对叶片愈伤组织诱导影响

  鸡树条荚蒾叶片分化诱导的过程见(图2),当培养至21 d时,主脉及边缘出现少量的愈伤组织;培养到35 d时主脉及叶缘全部愈伤组织化;继续培养时,部分叶片组织出现褐化现象,尚未获得不定芽。由K值(表4)可知,当6-BA浓度为2 mg/L、IBA浓度为0.1 mg/L、2,4-D浓度为2.0 mg/L时,诱导率最高,为93.33%。由极差可知(表4),6-BA、2,4-D、IBA的极差分别为26.02、9.73、0.64,说明6-BA是叶片愈伤组织诱导的主要影响因素。当6-BA浓度超过2 mg/L时,愈伤组织结构松散,褐化现象更为严重。由此确定叶片愈伤诱导培养基为:WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+2.0 mg/L 2,4-D。为减轻褐化造成的毒害,在预试验基础上添加50 mg/L VC、50 mg/L AC,褐化现象明显减轻。

  

 

  (A、B分别为21和35 d时愈伤组织诱导情况。)

  图2 鸡树条荚蒾叶片愈伤组织的诱导

  2.3 继代周期对不定芽增殖的影响

  多重比较分析可知,不同继代周期对不定芽增殖影响显著(P<0.05),随着继代周期的延长,不定芽的长度呈现出逐渐升高的趋势,增值倍数呈现出先升高后降低的趋势。当继代周期为35 d时,不定芽较多,茎节明显,增值倍数最高为7.39,不定芽长度为4.14 cm;当继代周期40 d时,不定芽生长缓慢,底部叶片变黄,培养基变干。由此确定鸡树条荚蒾茎段分化的继代周期为35 d。

  表4 不同激素浓度对叶片愈伤组织诱导的影响

  

 

  2.4 激素种类与浓度对不定芽生根的影响

  将长度超过2.5 cm的不定芽接入生根培养基,多重比较结果表明(表5),IBA、NAA浓度对不定芽的生根影响显著(P<0.05),生根数量、不定芽长度随着激素浓度的增加呈现先升高后降低的趋势。当WPM培养基中仅添加1.5 mg/L IBA时,不定芽的生根率最高,为90.91%,平均生根数为6.24条,10 d后开始生根,培养20 d时,有二级根形成,根多而长,呈辐射状生长(图3A、C)。而仅添加1.5 mg/L NAA时,不定芽基部先形成愈伤组织再生根,生根时间较长。当同时添加2种激素时,生根数少、根短而粗。由此确定鸡树条荚蒾生根的培养基为:WPM+1.5 mg/L IBA。

  表5 不同激素浓度对不定芽生根的影响

  

 

  注:表中同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

  

 

  图3 鸡树条荚蒾生根情况

  (A:未添加AC培养至40 d时,根部长势;B:添加AC培养至40 d时,根部长势;C:未添加AC培养至40 d时,植株长势;D:添加AC培养至40 d时,植株长势;E:鸡树条荚蒾移栽后长势。)

  2.5 活性炭浓度对不定芽生根的影响

  经多重比较可知,AC的添加对不定芽生根影响显著(P<0.05),生根数、根长及株高均随着AC添加量的增加呈现先升高后降低的趋势。当活性炭质量浓度为1 g/L时,生根率为94.62%,生根数为8.12条、根长为4.24 cm、株高为5.15 cm,根部呈辐射状生长,苗木健壮绿盈(图3B、D);当活性炭浓度超过1 g/L时,株高、生根数、根长均下降,且叶片颜色逐渐变浅。因此,在鸡树条荚蒾生根培养过程中活性炭的使用浓度为1 g/L。

  2.6 炼苗与移栽

  选取株高5~7 cm,生长健壮、根系发达的鸡树条荚蒾再生植株进行炼苗和移栽,移栽15 d开始有新叶形成,苗木成活率达100%(图3E)。

  3 结论与讨论

  研究建立了高效的鸡树条荚蒾组培再生体系,对鸡树条荚蒾的保存和繁育具有重要意义,也为其规模化生产及基因工程育种提供了重要参考。试验结果表明:适于茎段分化的培养基为:WPM+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+20 g/L 蔗糖,分化率为93.66%,同时以35 d为继代周期,不定芽的增值倍数为7.39;适于叶片愈伤组织诱导的培养基为:WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+2.0 mg/L 2,4-D,愈伤组织诱导率为93.33%,愈伤组织结构致密,颜色呈淡绿色;适于生根的培养基为:WPM+1.5 mg/L IBA+1 g/L AC,培养10 d后即可生根,生根率为94.62%,经过炼苗和移栽,成活率达到100%。

  在对兴山绣球(Viburnum tinus L.)研究时发现6-BA浓度对不定芽增殖影响较大,当6-BA浓度过高时分化芽出现玻璃化现象,说明高浓度的细胞分裂素对茎段分化不利。适宜的继代周期对不定芽生长及增殖有一定影响,继代周期过短,不定芽形成的数量少,继代周期过长,培养基变干,影响不定芽生长。此外,以不同激素对叶片进行愈伤组织诱导,初步得到颜色淡绿、结构致密的愈伤组织,但尚未分化出不定芽,因此鸡树条荚蒾叶片的组培再生还有待进一步研究。另外,叶片在培养过程中容易褐化,为此,在分化培养基中添加50 mg/L VC和50 mg/L AC,外植体褐化现象明显减轻。在对香荚蒾的生根研究中加入NAA与IBA效果较好。该研究中仅添加IBA有助于鸡树条荚蒾的生根,并且在生根培养基中添加1 g/L AC,根长有明显增加,利于苗木移栽和成活。

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